超低温疗法（cryotherapy）是在植物超低温保存技术基础上发展起来的一种新型脱毒技术，最初应用于植物种质资源的长期保存，后逐渐拓展至病毒脱除领域。该技术主要利用植物茎尖顶端分生组织与基部成熟组织在结构和生理状态上的差异，通过液氮（-196℃）超低温处理选择性破坏受病毒侵染的成熟细胞，而保留具有较强再生能力的无毒分生组织，随后经组织培养再生获得脱毒植株。
与传统茎尖培养脱毒方法相比，超低温疗法具有脱毒效率高、适用茎尖范围较广和操作稳定性较强等优势，可有效降低茎尖培养对茎尖大小（0.2~0.5 mm）的依赖。目前，超低温疗法主要包括玻璃化法、小滴玻璃化法、包埋干燥法、和包埋玻璃化法等，其中苹果超低温脱毒研究中应用较多的方法是小滴玻璃化法。
二、小滴玻璃化法
小滴玻璃化法超低温脱毒主要包括病毒检测、茎尖获取、预培养、玻璃化处理、液氮冷冻、解冻恢复及再生培养等步骤（图1）。
病毒检测：采用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技术对苹果材料进行病毒感染状态鉴定。使用CTAB法提取总RNA（≥500 ng/μL），总RNA反转录合成cDNA后进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照记录。
茎尖获取及预培养：选用4周苗龄试管苗进行取芽，顶芽长度为1.5~2.0 mm含5~6片叶原基。茎尖取下后在继代培养基上培养稳定1 d，后转入预培养液（MS+2.0 M甘油+0.8 M蔗糖）中预培养1 d。
玻璃化及液氮冷冻处理：预培养结束后将茎尖转入PVS2 [MS+30% (W/V)甘油+15% (W/V) 乙二醇+15% (W/V) DMSO+0.4 M蔗糖]中浸泡处理40 min后转到灭菌铝箔条上，然后在液氮中进行冷冻处理2 min。
卸载恢复及再生培养：冷冻处理后迅速将铝箔条浸入卸载液（MS+1.2 M蔗糖）中进行卸载恢复20 min。恢复后将茎尖取出，用滤纸短暂干燥后转入继代培养基中进行再生培养。
三、影响苹果茎尖超低温脱毒效率的因素及解决办法
1. 试管苗生理状态影响茎尖冷冻后的再生能力
适当延长试管苗培养时间（1~4 W）和低温（4℃）炼苗处理均可提高苹果茎尖超低温处理后的存活与再生能力。延长苗龄可通过降低细胞含水量、促进可溶性糖和脱落酸积累增强低温耐受性；低温处理则可诱导类似休眠的生理状态，提高抗寒性，维持细胞膜稳定，从而促进冷冻后茎尖再生。
2. 基因型差异及培养条件影响超低温耐受性
适当调整卸载液的蔗糖浓度（0.25 M，0.5 M，或1 M），PVS2玻璃化溶液的处理时间（5~60 min），或在固体恢复培养基（MS+0.75 M蔗糖）上培养数天（0，1，3，或7 d），可促进细胞渗透调节及胁迫响应，增强茎尖脱水与冷冻耐受能力，从而提高苹果茎尖超低温处理后的再生率。
3. 难脱除病毒需结合多种脱毒技术
部分苹果病毒由于能够侵染茎尖顶端分生组织区域，采用单一超低温疗法往往难以实现彻底脱除。例如，苹果茎沟病毒（ASGV）等。针对这类难脱除病毒，可通过热处理或化学疗法结合超低温处理（图2），进一步提高脱毒效率。
图2 热处理或化学疗法结合超低温处理脱毒技术流程
图文/苗木繁育与栽培方式岗位 张东 马娟娟 王敏瑞 马小燕 李晴
编发审核/国家苹果产业技术体系办公室
