图6-7  Kelly Archer（右）把初产的苹果蠹蛾卵给Laura Willett（左），以便Willett能够给苹果蠹蛾注射一种作为基因编辑实验的药剂，该实验于二月在位于华盛顿州瓦帕托美国农业部农业研究所实验室中进行。在这过程中，围绕在卵周围的细胞壁在放置短短的几分钟内会变得很坚硬，这就要求团队的操作要迅速、精准

突变的苹果蠹蛾不会扩散到附近的果园。但是在封闭起来的华盛顿州瓦帕托实验室，突变的苹果蠹蛾却给科研工作者提供了有关如何开创一个目标特异性害虫防治新时期的想法。
    美国农业部农业研究服务中心的遗传学家Steve Garczynski多年来一直在追踪苹果蠹蛾的标记基因，现在新的基因编辑工具为他提供了检验该理论的条件。通过敲除关键基因，他就可以搞清楚像物种特异性节育剂一样的化学物质到底是在破坏哪个关键生殖途径。

Garczynski说：“ 我正在努力找出苹果蠹蛾机体是怎样运作的，这样我才能弄明白怎样去干扰它”。

他使用众所周知的DNA编辑工具CRISPR在苹果蠹蛾基因组中创建精准的突变。去年，用同样工具人们创建了含有抗疟疾基因的蚊子。

世界各国的研究者都在使用相同的基因编辑工具直接消灭各种害虫，还能培育更好的作物，甚至还能弄清楚怎样去校正人类遗传病。

Garczynski的第一个实验主要集中在一个他认为能控制苹果蠹蛾性信息素受体的基因，即我们熟知的十二碳二烯醇受体。

他的理论是敲除十二碳二烯醇受体基因将会干扰雄性与雌性相遇。尽管他实验结果并不理想，但是他却碰巧有了另一个重大发现--可能是因为这里面涉及几个基因。

“这个发现纯属偶然，但是我们仅用那些基因编辑的苹果蠹蛾并使它们交配，发现雌蛾产卵量很少且没有一个能成活的”。Garczynski说，“ 研究表明，当雌性苹果蠹蛾释放十二碳二烯醇时就会吸引雄性苹果蠹蛾，这也预示着受精产卵，因此当敲除十二碳二烯醇受体基因后，雌虫就不能产卵了”。

图6-8 几个苹果蠹蛾在红外灯附近徘徊。繁殖这些苹果蠹蛾的目的是用于实验测定并被隔离在实验室

基因突变能使雌蛾不育。这个发现听起来有望被用于害虫防治，但如果突变的苹果蠹蛾不能再生殖，那么这个变异基因就不能遗传下去，也将不会再继续传播。

然而，因为证实苹果蠹蛾产有生活力的卵与信息素信号有关，所以科学家应该能够设计一种信息素类似物去干扰苹果蠹蛾的繁殖过程。

Garczynski说：“这种方法的应用就好比苹果蠹蛾避孕药。苹果蠹蛾是唯一一种有十二碳二烯醇受体的蛾子，因此这种方法是专门针对苹果蠹蛾的”。这并不像听起来那般牵强。研究阻塞信息素受体的化学物质也会扰乱苹果蠹蛾正常繁殖，已经研究将这种方法用于防治粮食害虫。

但是Garczynski的工作只是初步研究。他已经确定了超过100个基因，他想通过敲除这些基因来弄清楚苹果蠹蛾的哪种机理最适合其防控技术。大部分基因与阻挡或干扰其繁育有关，但并非所有基因都与此有关。

“如果我们敲除控制昆虫的关键基因，它将不能存活。但是如果我们能阻止苹果蠹蛾寻找苹果并在上面产卵，这就会大幅度的减少果园里苹果蠹蛾的种群数量和降低对果园的危害程度。”Garczynski说。

构建突变体

图6-9  研究人员在显微镜下将微量注射器针头插入初产苹果蠹蛾的卵。Willett精确操控针尖的能力使得他能成功地在苹果蠹蛾卵发育为幼虫之前对其进行基因编辑，最终其将变成成虫。美国农业部生物科学技术员Willett是Steve Garczynski团队的一员，他们的研究主要着眼于用基因编辑工具CRISPR去阻止苹果蠹蛾的繁殖

在确定了感兴趣的目标基因后，Garczynski制做了一条和双链DNA匹配的单链RNA。在CRISPR基因编辑系统中，这被认为是向导RNA，因为它会引导一种酶到需要剪切的基因位点。他没必要引入任何新的DNA，因为他只想通过剪切和敲除基因去看看是什么原因使苹果蠹蛾不育。

这个过程是通过将含有引导RNA和能剪切初产卵剪切酶的溶液注射到新产的卵内完成的，基因编辑也由他们自己完成。

正如听起来那样高科技，Garczynski说，研究最难的部分是使基因编辑系统进入苹果蠹蛾卵内而产生变异。

他说：“我们必须找到一个方法使苹果蠹蛾将卵产于载玻片上。卵的注射是该项目最重要的部分，它需要在产卵后15分钟内完成注射，因为我们需要在受精卵开始分化之前把注射液导入受精核内”。

该实验需要的苹果蠹蛾种群是由技师Laura Willett饲养的。为了收集虫卵做注射实验，她将100头苹果蠹蛾放入一个里面放内衬外面用幕布遮盖的黑色盒子，同时放入一堆显微镜载物片，为苹果蠹蛾提供产卵场所。

在产卵几分钟后，她得迅速将上面有卵的玻片取出并放在装配有一个微小针头和注射液的显微镜下，她的操作必须十分精准，否则这些卵都将无法存活。

       Willett说，“我得争分夺秒地工作，因为如果超过15分钟卵外表面的薄膜就会变硬”。

图6-10  正如显微镜中观察到的， Laura Willett在初产的苹果蠹蛾卵上练习插入玻璃微量注射器针头。精准的插入小针头对于成功地将基因加入到要修饰的苹果蠹蛾中是必不可少的。针尖小至4微米，而一根头发的直径大约在100到150微米的范围

它看起来像一个半透明的泡沫，有一个蜂窝状的涂层在外面。那么，是时候采集一批新卵了，仅在6天内幼虫就会孵化出来，孵化后用于遗传学的测定，成虫将用于繁殖下一代，繁育一代需要6周时间。

现在他们已经精化了他们的技术，Garczynski预计他的实验室每月应该都可以诱导出一些有突变基因的苹果蠹蛾，直到发现关键基因。

防治新时代？

最近，果农都在使用十二碳二烯醇发散器干扰雄性苹果蠹蛾，使它们很难找到雌性，从而阻止其交尾。但是，当苹果蠹蛾真正暴发成灾时，用性信息素干扰交尾的方法在苹果蠹蛾密度较高时就不能奏效了。并且化学药剂的应用受到限制，因为苹果蠹蛾幼虫大部分时间都在苹果内部蛀食，很难接触到药剂。

所有这些都使得苹果蠹蛾成为这种新型防控体系主要的候选者，这种新型防治方法不会破坏现有的有害生物综合治理体系。“如果我们能阻止性信息素通路，它如此高的专一性将不会使其产生脱靶效应”。Garczynski说。

这种精准害虫防控的商业化还需要几年。但无论是生殖干扰还是基因突变，Garczynski都是积极乐观的，因为至少有一种他的新见解可以使苹果蠹蛾在不久的将来得到控制。

（陈万斌 译，王勤英 校）